最近，美国南加州大学凯克医学院研究员在PLOS GENETICS杂志上发表关于筛选调节胶质母细胞瘤的长链非编码RNA的最新成果“CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastomainvasion”。编码基因是胶质母细胞瘤（GBM）的侵袭研究的主要对象，但是长链非编码RNAs（lncRNAs）由于表现出高度的细胞类型特异性表达和功能，已经成为基因治疗中有吸引力的新靶点。在本研究中，研究人员使用CRISPRi（CRISPR干扰）技术了进行lncRNA功能缺失筛选以评估与GBM相关lncRNAs的侵袭性功能，结合候选基因的机制表征和分析，最终确定LINC03045是胶质母细胞瘤侵袭中的关键非编码基因。这种新的lncRNA可能通过WASF3调控侵袭，进一步鉴定该基因有望使其成为未来胶质母细胞瘤治疗的治疗靶点。

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见和具有侵袭性的成人原发性恶性脑肿瘤，年发病率较高。已有的针对性治疗方法存在肿瘤复发，化疗和放射耐药性增加等缺陷。为了解决这些弊病，新的治疗策略和分子靶点成为人们的新需求。至今为止，很少有研究专门确定了针对胶质瘤的新的候选lncRNAs。对此，CRISPRi技术能够无偏倚地进行侵袭筛选。利用CRISPRi和寡核苷酸（ASO）的敲除，研究员们在三种肿瘤系验证了顶级筛选的候选基因。通过癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）生存分析评估了候选基因的临床相关性，结合敲除后的lncRNA差异表达分析，确定了lncRNA效应的中介物，并通过敲除和拯救实验评估了肿瘤的侵袭情况。

一、CRISPRi筛选可以识别影响侵袭的lncRNA

研究人员使用了CRISPRi进行基因敲除，以筛选和鉴定影响体外胶质瘤细胞侵袭的lncRNA。他们通过将U87特异性 CRISPRi 文库包装到慢病毒中，并转导到稳定表达 dCas9-KRAB 的 U87 细胞中，从中筛选获得1000 倍覆盖率的sgRNA。使用嘌呤霉素筛选感染细胞，并将其接种到 Matrigel Boyden 室中。侵染结束后从中筛选有效细胞提取DNA并进行测序分析。

研究员重复CRISPRi筛选过程，对筛选重复进行平均，并与非靶向对照组相比，使用每个 lncRNA 的前 3个sgRNA（Mann-Whitney P值)来确定筛选命中。该筛选评分通过火山图绘制出来，其中虚线表示确定屏幕命中率的阈值。在非侵袭细胞中，45个基因靶标在文库中显著富集，代表了胶质瘤细胞侵袭所必需的基因。最终研究员们通过这个过程确定了阳性命中，并且最合适的候选者被确定为10号染色体上的LINC03045（注释LH02236）。

图1 CRISPRi筛选方案结果

二、TCGA和GTEx辅助进行患者预后分析

为了更好地解释LINC03045，研究员们以每百万计数（CPM）进行测量，使用位置坐标来评估LINC03045的表达水平。胶质母细胞瘤GBM（3.6±0.27 CPM）和低级别胶质瘤LGG（2.06±0.30 CPM）的平均LINC03045基因表达量均高于正常脑皮层（0.67±0.06 CPM）（平均±SEM）。在肿瘤与对照中的比较中，LINC03045呈现出显著的表达变化。

研究员们采用LINC03045计数，对所有胶质瘤（2-4期）患者进行Kaplan-Meier（KM）生存分析。分为四分位数的队列显示，随着表达水平的增加，生存率显著降低（p<0.0001）。此外，队列的 Cox 回归分析显示，2.5 LINC03045 CPM将划分高风险组和低风险组。高危组 （>2.5 CPM） 的生存率显著降低 （p<0001）。每增加 1 次 CPM，从 0 到 2.5 CPM 的危害回归 （HR） 为 1.99。

此外，研究员们还分析了根据胶质瘤分级和 IDH 状态进行调整后的生存率。在 GBM 组群（4 期）中，生存率与 LINC03045 表达的变化无显著差异（p = 0.40）。调整IDH 状态后，在LGG队列（2-3级）中LINC03045的表达升高与生存率下降显著相关（p = 0.002）。而单独对IDH突变的2级胶质瘤进行生存分析（不包括20个非特异性分级的样本）显示，LINC03045的表达与生存无关（p=0.18）。

图2 来自癌症基因组图谱 （TCGA） 和基因型组织表达 （GTEx） 项目的患者神经胶质瘤样本中 LINC03045 的表达

三、单个sgRNA敲除可实现重复筛选鉴定的lncRNA表型

为了验证筛选出的候选基因在受到单lncRNA 抑制后是否具有可重现的表型，研究员们针对每个候选基因的前两个sgRNA进行了CRISPRi 敲除。结果表明，无论是敲除后转录表达还是侵袭试验，LINC03045都最明显具有效应大小和可重复性。

图3 验证CRISPRi筛选结果

四、反义寡核苷酸介导的LINC03045的KD在多个细胞系中与CRISPRi的结果一致

为了验证CRISPRi敲除技术在本研究中的功能筛选准确性以及评估该LINC03045敲除技术对减少恶性胶质瘤细胞入侵和利用药物方法转化的潜力，研究人员使用反义寡核苷酸介导的敲除技术作为第二KD方法进行确证，将其应用至到病人肿瘤系USC02、商业肿瘤系U87和U251三个胶质瘤细胞系中。结果，ASO KD后qPCR转录表达显示转录表达降低；MTT 测定显示， USC02、U87 和 U251 细胞中 ASO 对 LINC03045 进行 KD 后增殖没有变化；而ASO 介导的 LINC03045 KD 后，通过 Matrigel 测定评估体外侵袭显示USC02s、U87s和 U251s的侵袭减少。综合结果表明，反义寡核苷酸介导的LINC03045的KD在多个细胞系中呈现与CRISPRi相同的结果。

图4 反义寡核苷酸介导的多种细胞系中 LINC03045 的 KD 复制 CRISPRi 结果

五、通过 TCGA 和 GTEx 分析进行全基因组差异基因表达

为了了解LINC03045与全基因组基因表达变化的关联，研究员们进一步探索了TCGA和GTEx患者数据。首先，他们利用LINC03045的表达分布分析明确最高25%的患者和最低25%的患者之间有明显的区别。随后，他们基于LINC03045表达水平将TCGA-GBM患者分为两组，对LINC03045低表达患者队列的评估发现，基因表达发生了显著的整体改变，表现在与lncRNA低表达相关的改变最多的前100和500个基因中。KEGG通路分析显示，LINC03045的表达与氧化磷酸化以及核糖体和剪接体活性之间存在显著相关性。因本体分析表明，RNA转录、RNA 聚合酶 II 活性、RNA 剪接和染色质组织在 LINC03045 表达增加的过程中存在广泛关联。在涉及的基因本体通路中，WASF3 与涉及细胞骨架调节的富集通路（GO:0007010）显著相关。

图5 来自癌症基因组图谱 （TCGA） 和基因型组织表达 （GTEx） 项目的全基因组差异基因表达

六、WASF3 是 LINC03045 的下游介质

为了研究LINC03045的下游效应并明晰介导LINC03045活性的潜在机制，研究员们利用 U87 细胞对 LINC03045 进行了 ASO 介导的 KD，通过 RNAseq 评估基因的表达。RNAseq分析结果显示，在LINC03045基因敲除后，有几个基因显著上调或下调。当候选基因与TCGA患者LINC03045表达相关基因数据时，他们发现WASF3基因与LINC03045的表达显著正相关，并且WASF3是这些在LINC03045低表达的患者队列中唯一显著下调的候选基因。为了了解WASF3基因敲除后细胞侵袭的状况，他们通过基质分析进行评估，3D侵袭试验显示，与未转染的U87球状体相比，siRNA介导的WASF3球状体对周围基质的侵袭减少，进一步分析表明WASF3与LINC03045有统计学意义的正相关（p=0.016）。此外，他们也通过ASF3的过表达挽救患者衍生细胞系USC02在LINC03045 KD后的侵袭能力试验进一步证实了LINC03045和WASF3之间的关系。最后，WASF3拯救实验证实，WASF3过表达可恢复lncRNA KD造成的侵袭损失。综合分析证明WASF3介导了LINC03045的肿瘤效应。

图6 LINC03045 KD 细胞的 RNAseq 分析

图7 WASF3 影响侵袭

综上所述，研究员利用大规模CRISPRi进行功能筛选，确定LINC03045是胶质母细胞瘤侵袭中的关键非编码基因。同时通过RNA-seq和机制研究发现这种新的lncRNA可能通过WASF3调控侵袭最大配资平台，有可能为未来胶质母细胞瘤治疗提供新的治疗新靶点。

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